بررسی عملکرد mirnaی اینترونی مصنوعی (ضد) کالومنین در بالادست cdna ی فاکتور 9 انعقادی در رده ی سلولی پستاندار

نقص در فاکتور? انعقادی شایعترین عامل در بیماری هموفیلی b است. در حال حاضر بیماران هموفیلی b با روش جایگزین درمانی با پلاسمای ذخیره شده یا فاکتور ? نوترکیب مورد مداوا قرار می گیرند. گاما کربوکسیلاسیون گلوتامیک اسیدهای ناحیه ی gla فاکتور ? که توسط آنزیم گاماکربوکسیلاز انجام میگیرد به عنوان یکی از تغییرات بعد از ترجمه کلیدی برای فعالیت بیولوژیک این پروتئین ضروری است و همواره باید در هنگام تولید فاکتور9 نوترکیب مورد توجه قرار گیرد. توانایی بالقوه mirnaهای مصنوعی بیان شونده در درمان بیماری ها را باید منتسب به توانایی آنها در برش اختصاصی rnaی هدف آنها دانست. این نوع rnai (mirnai)، مزایای اصلی هر دو نوع sirna و mirna که به ترتیب هدف گیری اختصاصی و بیان دائم باشند را داراست. با در نظر گرفتن نقش باز دارندگی کالومنین بر روی گاماکربوکسیلاز، در این پژوهش ضمن طراحی دو mirna مصنوعی اینترونی بر علیه کالومنین، تاثیر آن بر بیان فاکتور 9 انسانی مورد بررسی قرار گرفته است. توالی رمز کننده ی mirna های مصنوعی ضد کالومنین در اینترون 1 کوتاه شده فاکتور 9، با اثر افزایندگی، در بالادست cdna ی فاکتور 9 انسانی قرار داده شد. پس از بررسی توالی ژن کالومنین انسان و همردیفی 6 واریانت آن دو sirna علیه توالی حفظ شده از این ژن طراحی شد و عملکرد هر یک از آنها در چارچوب یک mirna ی طبیعی، بنام mir-30a در داخل اینترون کوتاه شده 1 فاکتور 9 با بهره گیری از روش های نرم افزاری مورد پیش ‍ بینی قرار گرفت. توالی های طراحی شده طوری در نظر گرفته شدند تا در پردازش اینترون و تولید و بالغ شدگی mirna خللی وارد نگردد. پس از سنتز توالی رمز کننده دو mirna با نام های mir6 و mir5 که در اینترون 1 کوتاه شده فاکتور 9 قرار گرفته بودند، قطعه های مزبور با روش های مولکولی در ناحیه بالادست cdna فاکتور 9 در یک وکتور بیانی مجهز به پروموتر cmv قرار داده شد. پس از بررسی صحت مراحل همسانه سازی، پلاسمید های نوترکیب به صورت موقت به سلول های hek293t منتقل شدند و در ادامه میزان بیان ژن های کالومنین و فاکتور 9 انسانی در سلول های ترانسفکت شده در سطح رونویسی با روشreal-time pcr مورد بررسی قرار گرفت. نتایج اولیه بدست آمده از بررسی سلول های ترانسفکت شده با سازه های حاوی mir6 دلالت بر تولید mirnaی بالغ داشت اما کاهش بیان کالومنین مشاهده نشد که علت آن می تواند اشباع شدن exportin 5 بخاطر ازدیاد mirna های بیان شده باشد. با توجه به نتایج بدست آمده به نظر می رسد که mirnaی مصنوعی با اسکلت mir-30a بتواند از متن یک اینترون خارج شده و مراحل بلوغ را طی کند. علاوه بر این بیش بیان فاکتور ? نیز در این سلول ها در مقایسه با سلول های کنترل مشاهده شد که نشانگر پردازش کامل اینترون معرفی شده بود. به این ترتیب، علاوه بر تایید فراوری صحیح mirna مصنوعی بیان شده، کاربرد دوگانه اینترون شامل عملکرد ذاتی آن در بیان ژن مربوطه و نقش آن در حمل و تولید mirna مصنوعی مورد تایید قرار گرفت.